Grundläggande principer och arbetsflöde för fast-Peptide Synthesis (SPPS)
Peptidsyntes i fast-fas (SPPS)är en metod för att syntetisera peptider på ett fast underlag. De viktigaste SPPS-strategierna inkluderarBoc-metodenoch denFmoc-metoden. Peptidsyntes är en repetitiv process av sekventiell aminosyratillsats och utförs i allmänhet frånC-terminal (karboxylände)tillN-terminal (aminoände). Först fästs karboxylgruppen i den första aminosyran i målpeptiden kovalent till en fast bärare (harts). Med användning av aminogruppen för denna aminosyra som utgångspunkt avlägsnas den N--terminala skyddsgruppen och den växande peptidkedjan förlängs genom reaktion med ett överskott av en aktiverad andra aminosyra. Denna cykel-koppling → tvätt → avskydd → neutralisering och tvätt → nästa koppling-upprepas tills den önskade peptidlängden uppnås. Slutligen klyvs peptidkedjan från hartset och renas för att erhålla målpeptiden. När -aminogruppen är skyddad medBoc (tert-butyloxikarbonyl), kallas metodenBoc-baserad peptidsyntes i fast-fas. När -aminogruppen är skyddad medFmoc (9-fluorenylmetyloxikarbonyl), är det känt somFmoc-baserad peptidsyntes i fast-fas.
Boc-baserad fast-faspeptidsyntes (Boc-metoden)
I denBoc-metoden, Boc-grupper som kan avlägsnas med trifluorättiksyra (TFA)används för att skydda -aminogrupperna, medanskyddsgrupper av bensyl-typanvänds för sidokedjor. Under syntesen kopplas en Boc-skyddad -aminosyra först kovalent till hartset. Boc-gruppen avlägsnas sedan med TFA, och den resulterande fria aminoterminalen neutraliseras med trietylamin. Nästa aminosyra aktiveras med hjälp avDCC (dicyklohexylkarbodiimid)och kopplad för att förlänga peptidkedjan. Efter slutförandet av sammansättningen klyvs målpeptiden från hartset med användning av en stark syra, vanligtvisvattenfri vätefluorid (HF)ellertrifluormetansulfonsyra (TFMSA)I Boc-syntesmetoden krävs upprepade syrabehandlingar för att avlägsna skyddsgrupper före varje kopplingssteg. Detta kan leda till flera sidoreaktioner, såsom för tidig klyvning av peptiden från hartset och instabilitet hos aminosyrasidokedjor under sura förhållanden, vilket resulterar i oönskade sidoreaktioner.
Fmoc-baserad fast-faspeptidsyntes (Fmoc-metod)
I1978, Meienhofer och Athertonutvecklat en peptidsyntesstrategi med hjälp avFmoc (9-fluorenylmetyloxikarbonyl)som -aminoskyddsgruppen, känd somFmoc-metoden. I detta tillvägagångssätt skyddas -aminogruppen medbas-labil Fmoc, medan sidokedjorna skyddas medsyra-labila Boc-skyddsgrupper.En stor fördel med Fmoc som en amino-skyddsgrupp är dessstabilitet under sura förhållanden; det påverkas inte av behandling med reagens som t.extrifluorättiksyra (TFA)och kan selektivt tas bort med hjälp avmild bas. Samtidigt är sido-skyddsgrupper som Boc stabila under basiska förhållanden och avlägsnas under sur behandling. Slutligen klyvs peptiden kvantitativt från hartset med hjälp avTFA/diklormetan (DCM), undviker användningen av starka syror och förbättrar därigenom säkerhet och kompatibilitet med rutinsyntes av peptider.
Utvecklingshistoria för fast-Peptidsyntes (SPPS)
1. Grundstadiet (tidigt 1900-tal till 1963)
I1902, Emil Fischervar först med att utforska peptidsyntesen, men framstegen gick långsamt på grund av tekniska begränsningar. Tidiga synteser användsbensoyl- och acetylskyddsgrupper, som var svåra att ta bort och ofta ledde tillpeptidkedjeklyvning.
I1932, Max Bergmannoch medarbetare- introduceradebensyloxikarbonyl (Z) gruppsom en -aminoskyddsgrupp. Denna grupp kan tas bort underkatalytisk hydrering eller sura betingelser, vilket ger ett mer tillförlitligt verktyg för peptidsyntes och lägger grunden för utvecklingen av peptidsyntes i fast-fas på 1960-talet.
Under1950s, forskare syntetiserade framgångsrikt en mängd olikabiologiskt aktiva peptider, som t.exoxytocin och insulin. Dessa landvinningar förstärkte peptidkemin ytterligare och etablerade grunden för framväxten av peptidsyntes i fast-fas.
2. Banbrytande scen (1963)
I1963, Robert B. Merrifieldföreslogfast fas peptidsyntes (SPPS) metod, därC-terminal aminosyraär förankrad till ett hartsstöd och peptidkedjan förlängs genom upprepade cykler avavskyddning och koppling. Detta tillvägagångssätt förenklade avsevärt peptidsyntesprocessen och blev denföredragen metodför peptidsammansättning.
Merrifield användsBoc (tert-butyloxikarbonyl)för att skydda -aminogruppen. I slutet av 1960-talet utvecklade han ocksåförsta helautomatiska peptidsyntetiserarenoch framgångsrikt syntetiseratbiologiska proteinersåsomribonukleas (124 aminosyror). För dessa banbrytande prestationer belönades Merrifield medNobelpriset i kemi 1984.
3. Teknisk innovationsstadium (1972)
I1972, Lou Carpinoutvecklade9-fluorenylmetyloxikarbonyl (Fmoc) skyddsgrupp, vilket kan varaavlägsnas försiktigt under grundläggande förhållanden, vilket minskar sidoreaktioner. Detta gjorde den särskilt lämplig förkomplexa peptiderochautomatiserad syntes.
DeFmoc-metodengradvis ersatte Boc-metoden som mainstream-strategin. Automatiserade peptidsyntes baserade på bådaFmoc och Boc kemiutvecklades senare och kördeautomatisering av peptidsyntesoch avsevärt förbättra effektiviteten och reproducerbarheten.
4. Mognads- och expansionsstadium (1990-talet till idag)
Harts- och reagensoptimering:Utveckling avhög-laddande, hydrofila PEG-modifierade hartseroch effektiva kopplingsreagens som t.exHBTUochHATUhar avsevärt förbättrat effektiviteten och utbytet av fast-peptidsyntes (SPPS).
Teknisk integration:Nya tillvägagångssätt sommikrovågsassisterad-syntesochflödeskemihar förkortade reaktionstider och ytterligare ökade utbyten.
Grundläggande principer och arbetsflöde för SPPS:
Kärnprincipen för peptidsyntes i fast-fas ärstegvis konstruktion av en peptidkedja på ett fast underlag, använderskydda gruppstrategierochkondensations (kopplings)reaktioneratt uppnåeffektiv och kontrollerbar peptidsammansättning.
1. Rollen för det fasta stödet (harts) i fast-Peptidsyntes (SPPS)
A olösligt polymerharts-sompolystyren-divinylbensen tvärbundet-harts, Wang-harts eller Rinkamidharts-väljs som det solida stödet i SPPS. Hartsytan innehållerfunktionella grupper(t.ex. hydroxyl- eller aminogrupper) som kan bildaskovalenta bindningar med ena änden av peptidkedjan, vanligtvisC-terminal, förankrar peptiden till det fasta underlaget. Denna kovalenta bindning säkerställer att den växande peptidenförblir bundet till hartset under hela syntesen, vilket mycketunderlättar efterföljande reaktionssteg, tvättning och rening
2. Att skydda gruppens strategi i fast-Peptidsyntes (SPPS)
Under peptidsyntesen-aminogrupp, karboxylgrupp och reaktiva sidokedjor-funktionella grupperav aminosyror (som tiol, karboxyl och aminogrupper) är benägna attsidoreaktioner. För att förhindra dessa oönskade reaktioner,skyddsgrupperanvänds. Vanliga skyddsgrupper inkluderar:-Aminoskyddande grupper:
Boc (tert-butyloxikarbonyl):Syra-labil, lätt att ta bort undersura förhållanden.
Fmoc (9-fluorenylmetyloxikarbonyl):Stabil under sura förhållanden, kan tas bort undergrundläggande villkor(t.ex. piperidin/DMF-lösning).Sido-kedjeskyddsgrupper:Utvalda enligt de kemiska egenskaperna hos aminosyrasidokedjan. vanliga grupper inkluderarbensyl (Bn), tert-butyl (tBu), trityl (Trt), etc. Dessa grupper äravlägsnas i slutet av syntesenvanligtvis under peptidklyvning från hartset, med användning avsura eller andra specifika förhållanden.
3.C-Terminus till N-Terminussyntes i SPPS
Ifast-peptidsyntes (SPPS), börjar peptidsammansättningen vanligtvis vidC-terminal (karboxylände)och fortsätter stegvis motN-terminal (aminoände). Detta beror på attC-terminal aminosyra fästs först till det fasta underlaget, och efterföljande aminosyror kopplas tillfri aminogrupp i peptidkedjan som redan är bunden till hartsetgradvis förlängning av peptidkedjan.
4. Kopplingsreaktion i fast-Peptidsyntes (SPPS)
Skyddade aminosyror måste varaaktiverasså att deraskarboxylgrupper blir reaktiva, vilket gör att de kan bilda enpeptidbindningmed aminogruppen i den harts-bundna peptiden. Gemensamaktiverande reagensomfattakarbodiimider(t.ex. DCC, DIC),HOBt, HATU, ochPyBOP. När den väl har aktiverats reagerar karboxylgruppen med den fria aminogruppen i enkondensationsreaktion, bildar enamidbindningoch därigenom fästa den nya aminosyran till den växande peptidkedjan.
5.Repetitiva (cykliska) operationer i fast-Peptidsyntes (SPPS)
Processen innebärupprepa cykeln med avskyddning → koppling → tvätt, tilläggeren aminosyra per cykelför att gradvis förlänga peptidkedjan. Efter varjekopplingsreaktion, är hartsettvättas(t.ex. med lösningsmedel som DMF eller DCM) för att avlägsna oreagerade reagens, biprodukter och överskott av aminosyror. De-aminogruppen i den nyligen tillsatta resten avskyddas sedanexponering av en fri amin för att förbereda nästa kopplingsreaktion. Denna cykel upprepas tills den önskade peptidsekvensen är helt sammansatt.
6. Klyvning i fast-Peptidsyntes (SPPS)
När peptidkedjan har nått önskad längd är den detklyvs från det fasta underlagetanvända ett lämpligt reagens samtidigtta bort alla skyddsgrupper. Ett vanligt använt klyvningsreagens ärtrifluorättiksyra (TFA), vilket inte barabryter bindningen mellan peptiden och hartsetmen ocksåtar bort skyddsgruppersåsom Fmoc och Boc, vilket återställer peptiden till sinursprungsstat. När peptidkedjan har nått önskad längd är den detklyvs från det fasta underlagetanvända ett lämpligt reagens samtidigtta bort alla skyddsgrupper. Ett vanligt använt klyvningsreagens ärtrifluorättiksyra (TFA), vilket inte barabryter bindningen mellan peptiden och hartsetmen ocksåtar bort skyddsgruppersåsom Fmoc och Boc, vilket återställer peptiden till sinursprungsstat.
Genom dessa steg,fast-peptidsyntes (SPPS)aktiverareffektiv och kontrollerad sammansättning av peptidkedjor på ett fast underlag, undvika de komplicerade mellanreningsstegen som krävs i traditionell lösnings-fassyntes och avsevärtförbättra syntesens effektivitet och utbyte.
Genom dessa steg,fast-peptidsyntes (SPPS)aktiverareffektiv och kontrollerad sammansättning av peptidkedjor på ett fast underlag, undvika de komplicerade mellanreningsstegen som krävs i traditionell lösnings-fassyntes och avsevärtförbättra syntesens effektivitet och utbyte.
