Kort diskussion om flera unika metoder för ihåliga fibrer i inkluderande Bod-rening

Inclusion Bodies (IB) är olösliga proteinpartiklar med hög densitet insvept i membran som bildas när främmande gener uttrycks i prokaryota celler, särskilt i Escherichia coli. När det observeras under ett mikroskop är IB en region med hög refraktion, som uppenbarligen skiljer sig från andra komponenter i cytoplasman.

Inklusionskroppsbildning är relativt komplex, relaterad till proteinproduktionshastigheten i cytoplasman, koncentrationen av nyligen genererade peptider är hög och det finns inte tillräckligt med tid att vika sig för att bilda amorfa proteinaggregat. Inklusionskropparna är i grunden sammansatta av proteiner, varav mer än 50% är klonade produkter. Den primära strukturen för dessa produkter är helt korrekt, men den tredimensionella konfigurationen är fel, så det finns ingen biologisk aktivitet. Inklusionskroppsstorleken är 0,5-1μm, olöslig i vatten, endast löslig i denatureringsmedel som urea, guanidinhydroklorid, etc.

I E. coli kan inklusionskroppar förekomma på två platser i cellen: cytoplasma och perifer cytoplasma. Placeringen och egenskaperna hos inklusionskroppar i cellen beror på hur proteiner uttrycks.

Inneslutningarna i cytoplasman hos E. coli varierar i allmänhet i diameter från {{0}},2 till 1,5 μm, och olika proteiner har olika diametrar, såsom storleken på interferon är 0,811 μm, och storleken på prorennet är 1.281μm. I vissa fall är diametern på vissa inneslutningskroppar större än diametern på E. coli, vilket ger E. coli ett utsprång. I allmänhet har en cell bara en inklusionskropp.

 

Inklusionskroppsrening

 

Reningsprocessen för inklusionskroppen är i allmänhet:

Cellkrossning:

Den allmänna tekniken för cellkrossning är: höghastighetskrossning av vävnad, homogenisering av glashomogenisator, ultraljudsbehandling, upprepad frys-upptiningsmetod, kemisk behandling (vanligtvis med lysozymbehandling).

 

Inklusive kroppstvätt:

Inklusionskroppar är inaktiva fasta partiklar som bildas genom intracellulär agglutination av proteiner uttryckta av bakterier, som vanligtvis existerar i amorf, olöslig form. I inklusionskroppen står det verkliga målproteinet endast för cirka 50 %, och resten innehåller lipider, lipopolysackarider, nukleinsyror och heteroproteiner, som är bundna till inklusionskroppen och påverkar renatureringen av inklusionskroppsproteinet. Därför är tvättning före denaturering ett mycket nödvändigt steg.

Dessutom är tvättningen av inklusionskroppar till hjälp för att öka återveckningsutbytet av rekombinanta proteiner. Genom att ta bort föroreningar kan hinder i renatureringsprocessen minskas, så att proteinet kan vikas och sammansättas mer effektivt och därigenom förbättra aktiviteten och funktionen hos proteinet‌.

Tvättning används vanligtvis mindre än 1 % av det neutrala tvättmedlet, såsom Tween, Triton, Urea och NP40 plus EDTA och reduktionsmedel 2-merkaptotreitol (DTT), -merkaptoetanol upprepas många gånger, eftersom tvättmedlets tvättkapacitet förbättras med ökningen av lösningens jonstyrka, vid tvättning av inklusionskroppar kan tillsättas NaCl för att öka jonstyrkan.

Inklusionskroppar kan användas för att avlägsna andra komponenter i cellnedbrytningslösningen genom centrifugering eller filtrering, vilka båda drar fördel av olika fysikaliska egenskaper hos inklusionskroppar.

 

Centrifugering:

Inklusionskroppsproteiner är mycket tätare än samma volym av cellfragment, så inklusionskroppen kan separeras från resten av cellen med hjälp av centrifugering. Kontinuerlig centrifugering är den mest använda operationen för att erhålla inneslutningskroppar i industriell produktion. Eftersom tätheten hos cellfragmenten är mindre än den för inklusionskroppen, är sedimentationshastigheten mindre än den för inklusionskroppen. Kontinuerlig suspension och centrifugering kan centrifugera större delen av inklusionskroppen, medan cellfragmenten gradvis avlägsnas.
Filtrering (tangentiell flödesfiltrering) : På grund av de olika molekylstorlekarna på inklusionskroppar och lösliga proteiner kan filtreringsmetoden användas, vilket kan minska driftskostnaderna och göra det lätt att skala upp. Tangentiell flödesfiltrering (TFF) drivs av den transmembrana tryckskillnaden. Ämnen och föroreningar som är mindre än membranets porstorlek passerar genom membranet, medan föroreningar som celler med större partiklar fångas. Membranöppningen som vanligtvis används för filtreringstvätt är 0,1 μm. Hålfiber tangentiellt flödesmikrofiltrering kan direkt hantera högt fast innehåll av flytande material, färre steg, enkel drift, membranet kan användas upprepade gånger genom rengöring, minska utrustningsinvesteringar och driftskostnader, i linje med kraven för modulär automatiserad produktion.

 

Följande är ett applikationsfall för tvätt av inkluderande kroppar med hjälp av Guidling hålfiberkolonner.

Vi använde 94 cm2 0.1-0.45μm ihålig fiber för att koncentrera 250mL vätska (målproteinmolekylvikt 17kd). Under hela tvättprocessen undersöktes återvinningshastigheten för målprotein och membranflödesutarmning.

0-71min är koncentrationsprocessen, 71-224min är tvätt- och filtreringsprocessen. Under hela mikrofiltreringsprocessen ökade TMP gradvis, vätskeinloppshastigheten förblev oförändrad och det genomsnittliga materialflödet var 12LMH.

Resultaten visade att målproteinet var fullständigt fångat och återhämtningsgraden för målprotein var mer än 90 %. Styrande hålfiberpelare är stabila och lämpliga för denna applikation.

 

Inklusionskroppsupplösning:

Inklusionskroppar löses i allmänhet upp under tillstånd av denaturerande medel urea eller guanidinhydroklorid, och de upplösta inklusionskroppsproteinerna är fullständigt denaturerade, det vill säga förutom att den primära strukturen och kovalenta bindningarna bibehålls, alla vätebindningar och hydrofoba bindningar förstörs och hydrofoba sidokedjor är helt exponerade.

Urea och guanidinhydroklorid är medelstarka denatureringsmedel, som lätt avlägsnas genom dialys och ultrafiltrering. Den allmänna koncentrationen av urea 8-10M, guanidinhydroklorid 6-8M. Ureaupplösning har fördelarna med icke-jonisering, neutral, låg kostnad, avlägsnande av protein efter renaturering kommer inte att orsaka en stor mängd proteinutfällning, och upplösta inklusionskroppar kan renas med en mängd olika kromatografiska metoder, så det har använts i stor utsträckning .

 

Inklusionskroppsproteinåterveckning:

Det lösta rekombinanta proteinet måste vikas korrekt för att bilda ett funktionellt protein. Tekniker för renaturering inkluderar utspädning av proteinlösning till nästan neutral, avlägsnande av denatureringsmedel, renaturering på kolonn och gelfiltreringskromatografi. Bland dem är spädning av proteinlösning till nästan neutral och avlägsnande av denatureringsmedel en vanlig klassisk metod för renaturering, speciellt utspädningsrenatureringsmetoden har den högsta utnyttjandegraden.

Denaturerande borttagning:

Dialys: Fördelen är att volymen inte ökar, och borttagningshastigheten av denatureringsmedel kontrolleras genom att gradvis minska koncentrationen av extern permeabel vätska, men det tar lång tid och är lätt att bilda inaktiva proteinaggregat, vilket inte är lämpligt för storskalig drift och kan inte tillämpas på produktionsskalan.

Ultrafiltrering (TFF): lätt att kontrollera dialyshastigheten, oavsett om det är i forskning och utveckling, pilottest eller produktion, kan avlägsna denatureringsmedel (vätskeförändring + koncentration) genom ultrafiltrering (TFF).

 

Inklusionskroppsproteinrening:

Metoderna för proteinrening efter renaturering liknar de för rening av lösligt protein, nämligen jonbyteskromatografi, gelfiltreringskromatografi, affinitetskromatografi, utfällning av ammoniumsulfat, etc.

Inklusionskroppar har ingen biologisk aktivitet, det finns ingen anledning att oroa sig för förlusten av proteinaktivitet, och stora mängder uttryck kommer inte att leda till celldöd och maximera motståndet mot proteasattack. Jiuling ihåliga fibrer kan tillämpas flexibelt i nedströms reningsprocessen av inneslutningskroppar. I inklusionskroppstvättsteget, utmärkt prestanda, jämfört med centrifugaltvätt, kan användningen av nioåldersteknologi mikrofiltreringshålfiber för tangentiellt flödesfiltreringstvätt avsevärt förkorta processtiden, och den allmänna återvinningsgraden kan nå mer än 90%. Jiuling ihåliga fibrer kan också användas i proteinrenatureringssteget av inklusionskroppar. Grumligheten hos matarvätskan som filtreras med mikrofiltreringshålfiber kommer att reduceras avsevärt och proteinåtervinningshastigheten är hög; Användningen av ihålig ultrafiltreringsfiber kan inte bara ta bort denatureringsmedel, utan också förkorta den kromatografiska provladdningstiden, för att spara tid, minska volymen fyllmedel och minska produktionskostnaden. Återvinningsgraden för hålfiber för mikrofiltrering/ultrafiltrering varierar med olika material, och den allmänna återvinningsgraden kan nå 90-95 %.

Guidling Technology välkomnar dig att begära testkit för relaterade recensioner.

 

Om Guidling

Guidling Technology är ett nationellt högteknologiskt företag med fokus på bioläkemedel, cellodling, rening och koncentration av biomedicin, diagnos och industriella vätskor. Vi har framgångsrikt utvecklat centrifugalfilteranordningar, ultrafiltrerings- och mikrofiltreringskassetter, virusfilter, TFF-system, djupfilter, ihåliga fibrer, etc. Som fullt ut uppfyller tillämpningsscenarierna för bioläkemedel, cellodling och så vidare. Våra membran och membranfilter används i stor utsträckning vid koncentrering, extraktion och separation av förfiltrering, mikrofiltrering, ultrafiltrering och nanofiltrering. Våra många produktlinjer, från små laboratoriefiltrering för engångsbruk till produktionsfiltreringssystem, sterilitetstestning, fermentering, cellodling och mer, möter behoven för testning och produktion. Guidling Technology ser fram emot att samarbeta med dig!