Hur man väljer rätt ultrafiltreringsrör
Ultrafiltreringsrör som vanligtvis används för proteinkoncentration och buffertersättning används ofta i ultrafiltreringsrör. Det finns andra modeller som har olika volymstorlekar och ultrafiltreringsrör, beroende på målproteinets molekylvikt, volymen före koncentration och målkoncentrationsvolymen. Återanvändbar.
1. Välj ett lämpligt ultrafiltreringsrör, främst med tanke på MWCO och koncentrationsvolym. I allmänhet bör molekylvikten inte vara större än 1/3 av molekylvikten för målproteinet. Om molekylvikten för målproteinet är cirka 10 kd kan ett ultrafiltreringsrör med en bibehållen molekylvikt på 3 KD användas.
2. Den nyinköpta ultrafiltreringen är torr. Tillsätt milliq vatten före användning. Vattnet passerar helt genom membranet och förkyles i ett isbad eller kylskåp i några minuter. Häll sedan ut vattnet för att tillsätta proteinlösningen. Mängden proteinlösning får inte överstiga den vita linjen på toppen av provröret. Enkel drift. Innan proteinlösningen tillsätts måste ultrafiltreringsröret sättas in i isen för förkylning.
3. Balans. Massan och tyngdpunkten måste balanseras. Observera att hastigheten och accelerationen inte bör vara för snabb, annars kommer ultrafiltreringsmembranet att skadas direkt. Starta centrifugal ultrafiltrering (förkyla centrifugen till 4 grader). Riktningen på membranet och den roterande axeln kan justeras enligt instruktionerna (vid vinkelcentrifug är membranet vinkelrätt mot axeln). Vid faktisk användning är den allmänna hastigheten lägre än den som anges i manualen, vilket kan förlänga livslängden på centrifugalröret.
4. När den är koncentrerad till de återstående 1 ml, [ta 50 ul hushållslösning från Bradford, tillsätt 10 ul vätska för att se om den blir blå och avgör om ultrafiltreringsröret läcker proteinet. Om röret läcker, häll det i det övre lagret och flyt sedan tillbaka till det nya röret för att starta ultrafiltrering. För att noggrant avgöra om provröret läcker, centrifugera 5 mg 10 min 10 min, passera sedan igenom det, kör proteingelen eller Bradford] [grov mätning]. Fortsätt att tillsätta den återstående proteinlösningen för att koncentrera sig (operera på is för att förhindra upphettning av protein) tills alla koncentrerade lösningar har tillsatts. Under centrifugering, var uppmärksam på om proteinutfällning sker och orsakar rörblockering. Om utfällning inträffar, vänligen fastställa den specifika orsaken till utfällningen, om proteinkoncentrationen är för hög eller om bufferten är olämplig; Det förra kan lösas genom att använda flera ultrafiltreringsrör samtidigt för att minska koncentrationen, medan det senare kan byta olika buffertar tills proteinet faller ut.
5. De föregående stegen används för att koncentrera protein. Om bufferten ska bytas ut, när den totala proteinlösningen är koncentrerad till cirka 1 ml, tillsätt försiktigt en ny buffert (ultrafiltrering genom 0.22um ultrafiltreringsmembran), och koncentrera sedan kontinuerligt till cirka 1 ml i tre gånger, så att den slutliga koncentrationen beror på den erforderliga proteinkoncentrationen, som vanligtvis inte är mer än 500 ul eller mindre än 200 ul. Enligt volymkoncentrationen på minst 10 gånger varje gång är den mer än 1000 gånger den tre gånger, vilket i princip kan uppnå syftet med att byta buffert.
6. Ta bort det slutliga proteinkoncentratet. Operera på is. Använd en gul pipettspets (200 ul), för försiktigt in pipettspetsen längs kanten, blås sedan försiktigt och blanda proteinlösningen. Var försiktig så att du inte rör vid ultrafiltreringsmembranet. Sug den koncentrerade lösningen till 200 ul varje gång tills den är helt sugen. Det är inte nödvändigt att extrahera den sista koncentrerade lösningen i botten av provröret, annars är det för svårt och ultrafiltreringsmembranet kan skadas. Slutligen tillsätts milliq vatten till ultrafiltreringsröret utan att passera genom ultrafiltreringsmembranet för att förhindra vattenförlust och uttorkning av membranet.
7. Följande är stegen för behandling av ultrafiltreringsröret och återanvändning av ultrafiltreringsröret.
8. Häll vatten i ultrafiltreringsröret och skölj försiktigt med milliq vatten flera gånger. [om det finns uppenbar proteinfällning i botten av provröret kan du först tillsätta vatten och sedan blåsa bort det med en pipett. Var försiktig så att du inte rör vid membranet. Sedimentet hänger ner och springer sedan iväg. Du kan inte spola den med kranvatten. Efter tillsats av 0.2m NaOH-lösning, placera den i rumstemperatur i 20 minuter och balansera ultrafiltreringsröret under denna period. Centrifugera i ytterligare 10 minuter. Häll ut den återstående NaOH-lösningen och doppa ned bomullskärnan i bägaren (1 eller 2L) Milliq-vatten, placerad i flera timmar, och ersätt sedan med nytt vatten, placerad i flera timmar för att kontinuerligt späda ut koncentrationen av NaOH. Tvätta 50ml provröret och täck med kranvatten, och tvätta innerväggen med milliq vatten.
9. Ta ut den nedsänkta provrörskärnan, tillsätt den till hela milliqvattnet och fyll sedan 50ml provröret med milliqvatten. Lägg långsamt rörets kärna i 50 ml.
Centrifugera röret, töm och dela vatten, täck sedan över och förvara vid 4 grader tills nästa användning. Generellt sett, enligt ovanstående steg och försiktighetsåtgärder, kommer varje rör inte att gå sönder inom tre eller fyra år.
