Industriell-reningsprocess i nedströms skala för bovint infektiös rhinotracheitis (IBR) vaccin – avsnittet "Ultrafiltrering"
Bovin infektiös rhinotracheitis (IBR) orsakas av infektion med bovint infektiös rhinotracheitis-virus (IBRV), även känt som bovint herpesvirus typ 1 (BHV-1). Sjukdomen kännetecknas främst av luftvägssymptom och abort. Utöver dessa kliniska manifestationer kan IBR leda till minskad mjölkavkastning hos mjölkboskap och minskad viktökning hos nötkreatur, vilket resulterar i betydande ekonomiska förluster för djurgårdar.
Sjukdomen är immunsuppressiv till sin natur. När den förekommer som en enstaka infektion är dess patogenicitet relativt låg; men när blandade infektioner med andra virus- eller bakteriesjukdomar uppstår ökar svårighetsgraden och skadorna avsevärt. Vaccination är den mest effektiva metoden för förebyggande och kontroll, med två huvudtyper av vacciner tillgängliga: levande försvagade vacciner och inaktiverade vacciner. För närvarande är de bovina infektiösa rhinotracheitisvaccinerna som används på gårdar till övervägande del inaktiverade vacciner.
Levande försvagade vacciner kännetecknas av stark immunogenicitet, snabbt insättande av immunitet och lång skyddstid (vanligtvis mer än sex månader). De används ofta för akut immunisering under sjukdomsutbrott. De medför dock potentiella risker för virusutsöndring, utgör risker för dräktiga kor och kan inte användas på latent infekterade men asymtomatiska nötkreatur.
Inaktiverade vacciner kännetecknas av hög säkerhet, utan risk för virusutsöndring eller återgång till virulens, och anses vara absolut säkra. De kan användas i nötkreatur i alla stadier, inklusive dräktiga kor, kalvar och avelstjurar. Emellertid är immuniteten relativt långsam och skyddets varaktighet är kortare, så boosterimmuniseringar krävs vanligtvis. I vissa fall kan den skyddande effekten vara svagare än den för levande försvagade vacciner.
Oavsett om ett levande försvagat vaccin eller ett inaktiverat vaccin används kan nedströmsreningsprocessen delas in i fyra huvudsteg: skörd och klarning → koncentration och primär rening → poleringsrening → inaktivering/steril filtrering och formulering.
Koncentration är ett kärnsteg i nedströmsreningen av vacciner, omedelbart efter klargörandet. Dess primära mål är att snabbt reducera den skördade stora-volymen, låg-koncentrationen av virusklarerad lösning till en liten-volym, hög-form samtidigt som den virala bioaktiviteten bibehålls. Detta skapar de nödvändiga förutsättningarna för efterföljande finreningssteg med hög-upplösning men låg-kapacitet, såsom kromatografi.
Detta steg utförs vanligtvis med tangentiell flödesultrafiltrering (TFF). Principen är följande: den virala matningslösningen flyter parallellt med ytan av ett ultrafiltreringsmembran med en specifik porstorlek. Under tryck passerar små molekyler som vatten, salter och vissa föroreningar vinkelrätt genom membranet och avlägsnas, medan intakta viruspartiklar, som är mycket större än membranporerna, hålls kvar, recirkuleras kontinuerligt och koncentreras. Jämfört med traditionell-höghastighetscentrifugering är den här metoden skonsammare för ömtåliga virus som IBRV, som har ett lipidhölje. Det minskar effektivt virusstrukturella skador och aktivitetsförluster orsakade av höga skjuvkrafter och är mer mottaglig för linjär uppskalning- för industriell produktion.
En framgångsrik koncentrationsoperation är mycket mer än att bara minska volymen. Nyckelpunkter för processoptimering inkluderar: exakt kontroll av transmembrantrycket och matningsflödet för att balansera filtreringseffektiviteten samtidigt som koncentrationspolarisering och membrannedsmutsning minimeras; val av lämpligt membranmaterial och porstorlek för att säkerställa hög virusretention och permeatflöde; och hitta den optimala balansen mellan virusåtervinning, koncentrationsfaktor och bearbetningstid. Den koncentrerade virussuspensionen uppnår inte bara en betydligt högre titer utan uppnår också preliminär rening genom att ta bort en stor del av vatten-lösliga föroreningar. Detta ger den nödvändiga volymen och koncentrationsgrunden för efterföljande kritiska förfiningssteg, såsom kromatografi och nukleasbehandling, vilket gör koncentration till ett centralt effektivitetsnav i hela nedströmsprocessen.
Sekundär diafiltrering är ett kritiskt steg i vaccin nedströmsrening, placerad efter finrening och före formulering. Det utförs vanligtvis efter kromatografi och nukleasbehandling. Dess huvudsakliga syfte är inte initial koncentration, utan systemutbyte och exakt justering av de slutliga formuleringsförhållandena. Processen utförs i ett tangentiellt flödesultrafiltreringssystem (TFF), där färsk, ren formuleringsbuffert kontinuerligt tillsätts till den cirkulerande koncentrerade viruslösningen, medan det ursprungliga lösningsmedlet och små-molekylföroreningar avlägsnas. Denna operation eliminerar effektivt och skonsamt restsalter, organiska lösningsmedel, nukleasnedbrytningsprodukter och spårlösliga föroreningar som finns kvar från reningsprocessen.
Nyckeln är att bibehålla konstant volym eller göra mindre koncentrationsjusteringar för att säkerställa att viruskoncentrationen uppfyller formuleringsspecifikationerna. För ömtåliga, höljeförsedda virus såsom bovint infektiöst rhinotracheitisvirus (IBRV), är den milda hydrodynamiska miljön med sekundär diafiltrering avgörande för att bevara partikelintegritet och immunogenicitet. I slutändan ger detta steg en solid grund för efterföljande inaktivering (om så krävs), tillsats av adjuvans eller stabilisator och slutlig fyllning, vilket säkerställer att slutprodukten kommer in i formuleringen med definierade komponenter, enhetliga förhållanden och god kompatibilitet. Det är därför ett av kärnstegen för att säkerställa vaccinsäkerhet, stabilitet och enhetlighet från batch-till-batch.
IBRV är ett hölje, dubbel-strängat linjärt DNA-virus med ett ungefärligen sfäriskt hölje. Mogna IBRV-partiklar har en diameter på cirka 160–230 nm. Följaktligen kan användning av 100, 300 eller 500 kDa ultrafiltreringsmembran behålla IBRV samtidigt som vissa kontaminerande proteiner avlägsnas. Ultrafiltreringsåtervinningsgraden för Jiuling Technology-membrankassetter varierar med typen av matningsmaterial, men når i allmänhet 90–95 %.