Studie om förtydligande av högdensitetsfermentationslysat av rekombinant Escherichia Coli

 

För att minska interferensen av materialvätska till kromatografin och förbättra återvinningen av målprotein studerades klarningsprocessen av högdensitetsfermentationslysat av två stammar av rekombinant Escherichia coli. Stammarna BL21-HP1036 och BL21-palA som uttrycker nyckelgener från Streptococcus suis och Haemophilus parasuis valdes ut. Tangentialflödesprocess, höghastighetscentrifugeringsprocess och membrankassettklarningsprocess användes för att utvärdera proteinutbytet genom grumlighet och elektroforesdetektion.

 

Resultaten visade att BL21-HP1036, BL21-palA högdensitetsfermentationslysat som uttrycker nyckelgener från Streptococcus suis och Haemophilus parasuis klargjordes genom membrankassettfiltrering och centrifugering, och proteinutbytet var över 80 %, vilket effektivt skulle kunna minska den kromatografiska interferensen och förbättra återhämtningshastigheten.

 

Introduktion

För närvarande är Streptococcus suis (SS) och Haemophilus parasuis (HPS) de vanligaste patogenerna för bakteriesjukdomar i grisfarmer, vilket medför stora förluster för grisindustrin. SS kan delas in i totalt 35 serotyper 1-34 och 1/2, och HPS kan delas in i 1-15 serotyper, och de två är ofta blandade, vilket främst orsakar svinpolyserosit, artrit, meningit, endokardit , bakteriell septikemi och bronkit.

 

På grund av det stora antalet serotyper av Streptococcus suis och Haemophilus parasuis är korsskyddet mellan olika serotyper svagt, och antibiotikaresistensen kommer att öka avsevärt vid behandling med antibiotika, vilket kommer att påverka den terapeutiska effekten.

 

Vacciner har blivit ett av de effektiva sätten att förebygga SS och HPS. Det finns inaktiverade vacciner, försvagade vacciner, levande vacciner, subenhetsvacciner och genmanipulerade vacciner, men inaktiverade vacciner och försvagade vacciner finns främst på marknaden och deras immunskydd är bra, men korsskyddet är inte uppenbart. Subenhetsvaccin är en ny typ av vaccin mot streptokocker suis, vilket är en ny typ av vaccin med starkt korsskydd och lågt pris. Forskning och utveckling av underenhetsvacciner av Streptococcus suis och Haemophilus parasuis ger en perfekt lösning på förebyggande och kontrollproblem av Streptococcus suis och Haemophilus parasuis som plågar grisindustrin i Kina.

 

Streptococcus suis och Haemophilus parasuis subenhetsvacciner utsätts för högdensitetsjäsning av rekombinant Escherichia coli. Klargöring av lysatet har stor effekt på utbytet av målproteiner, men det finns få relevanta rapporter. Hur man förverkligar klargöringssteget i jäsnings- och reningsprocessen är ett viktigt arbete. I denna artikel har rekombinant E. coli BL21-HP1036, BL21-palA högdensitetsjäsning som syfte att studera hur man effektivt kan minska grumligheten i den klargörande lösningen, förbättra proteinutbytet, för Streptococcus suis subenhet vaccin fermenteringsprocess för att uppnå industriell krossning och klarningsteknik för att ge teoretisk grund och tekniskt stöd.

 

1. Material och metoder

1.1 Material

 

1.1.1 Stammar

Streptococcus suis och Haemophilus parasuis-stammarna BL21-HP1036, BL21-pa-lA

 

1.1.2 Huvudmedia och reagenser

Jästextrakt och tumlare; Natriumklorid; kanamycin, IPTG; Formaldehyd från; SDS-PAGE gel kit.

 

1.1.3 Huvudtestutrustning

Fermentor med hög densitet; Höghastighetscentrifug; Elektroforesapparater; Ultraviolett gel avbildningssystem; Ultraljudskross; Liten höghastighetscentrifug; Ultraviolett spektrofotometer; Skakbord med konstant temperatur; Affinitetskromatografiutrustning.

 

1.2 Metoder

 

1.2.1 Högdensitetsjäsningskultur

De kvalificerade rekombinanta koliforma stammarna BL21-HP1036 och BL21-pa-lA inokulerades på syntetiskt medium vid 2 % (V/V) och odlades vid 37 grader i 35-40 timmar.

 

1.2.2 Rekombinant proteininducerad expression

När fermenteringslösningen OD{{0}}±0.1 började induktionen, induktionstemperaturen var 35 grader ±0,5 grader och odlingen avslutades efter 10 timmars induktion.

 

1.2.3 Högtrycks homogen krossning och centrifugering

Bakterievätskan som klarade inaktiveringstestet krossades av en högtryckshomogenisator för cellsprickning, med ett tryck på 100~150 MPa. Efter krossning hölls den krossade vätskan vid låg temperatur.

Supernatanten erhölls genom centrifugering med hög hastighet, centrifugalhastighet: 15000 rpm, temperaturkontroll:10 grader ~15 grader, injektionshastighet: 0,5~1 l/min, respektive supernatanten samlades upp och supernatanten fylldes med behållare som avlägsnade endotoxin.

 

1.2.4 Klargöring av mikrofiltreringsmembrankassett

Membranet tvättades med 1 0L renat vatten i en riktning, och tangentiell flödesfiltrering utfördes. 300 ml av den trasiga bakteriesuspensionen efter centrifugering togs från rörledningscentrifugen och klarnades med 0,45 um mikrofiltreringsmembrankassett. Grumligheten mättes genom provtagning respektive, och grumligheten efter centrifugering, grumligheten hos den klarnade vätskan i mikrofiltreringsmembrankassetten och grumligheten hos den koncentrerade vätskan i mikrofiltreringsmembrankassetten jämfördes. Proteininnehållet i provet detekterades genom kromatografi och elektrofores för att utvärdera proteinutbytet.

 

Steg 2: Resultat

2.1 Förtydligande data och testresultat av BL21-HP1036 och BL21-palA-protein

Resultaten i FIG. 1 visar att grumligheten för BL21-HP1036 och BL21-palA rekombinant Escherichia coli krossvätska minskade från 4 500 NTU och 4 000 NTU till 1970 NTU respektive 520 NTU, efter rörcentrifugering. Grumligheten för BL21-HP1036 och BL21-palA rekombinant Escherichia coli reducerades till 25 NTU och 1,28 NTU med mikrofiltreringsmembrankassettmetod. Det kan ses att användningen av tangentiellt flödesfiltrering av mikrofiltreringsmembran och optimerad öppen flödeskanal har en god effekt på att reducera endotoxin, viskositet och grumlighet hos kromatografisk vätska än den traditionella centrifugfiltreringen och avsevärt kan minska det trasiga rekombinanta E. coli-heteroproteinet. och nukleinsyra.

 

2.2 Proteinåtervinning av BL21-HP1036- och BL21-palA-prover

Tabell 1 visar att rekombinant Escherichia coli BL21-HP1036-protein finns i både den mikrofiltreringsklarade lösningen och den koncentrerade supernatanten som täcks av mikrofiltreringsmembranet, och det totala proteinutbytet efter utvinning av proteinet från den mikrofiltreringsklarade lösningen och den koncentrerade supernatanten är cirka 88,5 %. BL21-palA-protein fanns också i den mikrofiltreringsexsudat-klarade lösningen och supernatanten av den koncentrerade lösningen täckt av mikrofiltreringsmembrankassetten. Det totala utbytet av BL21-PALa-protein var 81,5 %.

 

3. Slutsats

I denna artikel genomgick stammarna som uttrycker nyckelgenerna BL{{0}}HP1036 och BL21-palA av Streptococcus suis respektive Haemophilus parasuis högdensitetsjäsning och passerade 0,45. Grumligheten hos materialvätskan var signifikant reducerad av um-mikrofiltreringsmembrankassettprocessen, vilket indikerar att tangentiellt flödesfiltreringsteknologi med mikrofiltreringsmembrankassett var bättre än den med höghastighetscentrifug och avsevärt kunde reducera föroreningsproteinet och nukleinsyran i den trasiga rekombinanta Escherichia coli.

 

Efter uppsamling av den klara vätskan i den enkla mikrofiltreringsmembrankassetten fanns det 62,9 %. Som 37,1 % av målproteinet för BL21-HP1036 var mikrofiltreringskoncentrat eller fanns i mikrofiltreringsmembrankassetten och andra förluster , antogs en tvåstegsmetod för förtydligande. I det första steget användes 0,45 um mikrofiltreringsmembrankassett för att klarna och samla upp exsudatet; i det andra steget samlades den återstående koncentrerade vätskan upp efter rörcentrifugering och den klarnade tvåstegsvätskan kombinerades som det kromatografiska provet. Grumlighetsvärdet för BL21-palA fermenteringsvätska ökade inte signifikant, proteinutbytet kunde nå mer än 85,5 %, och proteinutbytet av BL21-Pala-jäsningsvätskan kunde nå 81,5 % efter tvåstegsbehandling.

 

När det gäller hur man väljer mikrofiltreringsmembrankassetten kan Guidling Technology förse dig med högkvalitativa lösningar. Våra produkter i serierna av mikrofiltreringsmembrankassetter och ultrafiltreringsmembrankassetter använder polyetersulfon som bärare, speciellt designad för bioteknik. Vårt polyetersulfonmembran har fördelarna med hög genomströmning, låg proteinadsorption, hög mekanisk hållfasthet, slaghållfasthet och så vidare. Vi förser dig med speciella membranklämmor för att mäta trycket på inloppet och utloppet i realtid, och kan ge tekniska besök enligt dina behov för att anpassa ditt speciella ultrafiltrerings-/mikrofiltreringssystem. Ett sådant litet tangentiellt flödessystem kan användas för små-, pilot- och småskalig produktion, och kan vara helt linjär förstärkning för att fullt ut uppfylla dina testkrav och produktionskrav.

Om Guidling

Guidling Technology är ett nationellt högteknologiskt företag med fokus på bioläkemedel, cellodling, rening och koncentration av biomedicin, diagnos och industriella vätskor. Vi har framgångsrikt utvecklat centrifugalfilteranordningar, ultrafiltrerings- och mikrofiltreringskassetter, virusfilter, TFF-system, djupfilter, ihåliga fibrer, etc. Som fullt ut uppfyller tillämpningsscenarierna för bioläkemedel, cellodling och så vidare. Våra membran och membranfilter används i stor utsträckning vid koncentrering, extraktion och separation av förfiltrering, mikrofiltrering, ultrafiltrering och nanofiltrering. Våra många produktlinjer, från små laboratoriefiltrering för engångsbruk till produktionsfiltreringssystem, sterilitetstestning, fermentering, cellodling och mer, möter behoven för testning och produktion. Guidling Technology ser fram emot att samarbeta med dig!