Studie om virusrensande förmåga hos monoklonala antikroppar nedströms

Biotekniska produkter som härrör från cellinjer kan löpa risk för viruskontaminering - omfattningen beror på ett antal faktorer, inklusive källan till beredningen, de använda råvarorna, produktionssystemet, reningsreagenser och hjälpämnen. Att studera borttagning eller inaktivering av virus i tillverkningsprocessen är ett nyckelsteg för att minska risken för iatrogen överföring av patogena virus och därmed minska risken, vilket är avgörande för produkters säkerhet. Innan biologiska produkter kan gå in i kliniska prövningar och marknadsföras måste deras tillverkningsprocess påvisas ha förmågan att ta bort kända och förmodade virus.

 

01 Monoklonal antikroppsprodukt virussäkerhetsbedömning

Forskningen om förmågan att avlägsna virus är vanligtvis genom att lägga till det kända titerindikatorviruset till mellanprodukten i olika produktionsstadier, sedan bestämma restvirustitern i provet som behandlats med en specifik process, och slutligen utvärdera logreduktionsvärdet (LRV) av virustitern. Processsteg för LRV Större än eller lika med 4log10 anses generellt vara effektiva virusborttagningssteg. Processen med LRV<41og10 can be considered as helpful to increase the total virus clearance in the production process. However, due to the limitations of virus verification, the process with LRV≤11og10 has little significance for virus removal, and its LRV value is not included in the total amount of the production process.

När man använder metoden för simulerad produktionsprocess (reducerad process) är det nödvändigt att utforma en rimlig forsknings- och testplan för virusborttagning/-inaktivering relaterad till den faktiska produktionsprocessen så långt som möjligt, särskilt de effektiva produktionsprocessstegen. Den simulerade processen bör vara strikt överensstämmande med den faktiska processen när det gäller testparametrar och kontrollförhållanden.

 

02 Indikerar vanligtvis virus och verifieringssystem

Vanliga indikatorvirus visas i tabell 1.

På IND-stadiet kräver en bioteknisk produkt virala clearance-studier för minst 2 modellvirus, vanligtvis ett retrovirus (X-MuLV) och ett parvovirus (MMV). Under fasen för ansökan om biologiska licenser (BLA) utförs virusborttagningsstudier vanligtvis med hjälp av 3-5 specifika/icke-specifika virus och 3-5 processsteg utvärderas för att visa att produkten har en adekvat säkerhetsfaktor från en virussäkerhetsperspektiv. På grund av olika riktlinjer hemma och utomlands finns det vissa skillnader i verifieringsstegen för virusrensning som används för deklarationer. De vanligaste verifieringsschemana för virusclearing i mAb-produktionsprocessen visas i tabell 2.

 

03 Virusborttagningsförmåga för nedströmsprocesser

3.1 Nedströmsprocessers förmåga att ta bort olika virus

Från och med 2009 har monoklonala antikroppsprodukter lämnats in till FDA för IND och BLA, protein A affinitetskromatografi, lågt pH, anjonbyteskromatografi AEX (flödespenetrationsläge), katjonbyteskromatografi CEX (bindning - elueringsläge) och virusclearance validering exklusive virusfiltrering är de vanligaste indikatorvirusfamiljerna och medelvärdet och intervallet för deras elimineringseffekter visas i figur 1.

För retrovirus, med undantag för CEX, som har ett LRV på cirka 3log10 (som visas i A-stapeldiagrammet i figur 1), var de andra processerna robusta (LRV större än eller lika med 4log10). Herpesvirus och retrovirus har liknande elimineringseffekter och LRV > 4log10 (som visas i B-stapeldiagrammet i figur 1). Små icke-höljevirus, såsom parvovirus, är svårare att ta bort effektivt, är resistenta mot kemisk behandling och fångas inte lätt av filter (visas i C-stapeldiagrammet i figur 1). Endast AEX och små virusfilter var effektiva för att ta bort parvoviridae (genomsnittlig LRV > 4log10).

Processerna som visas i figur 1 är ProteinA, AEX (flödespenetrationsläge), CEX (samverkans-elueringsläge), lågt pH-inaktivering ("ofullständig "versus" fullständigt "avlägsnande) och devirusfiltrering med stor och liten öppning.

 

3.2 Påverkande faktorer för nedströmsprocesser på virusborttagningsförmåga

Fördelningen av LRV-värden för varje process visas i figur 2. Studierna med 0 ~ 21og10 klassificerades som låg LRV-grupp, och de med mer än 6log10 klassificerades som hög LRV-grupp för jämförande analys.

 

3.2.1 ProteinA-affinitetskromatografi

Det fanns ingen signifikant korrelation mellan LRV-värdet för Protein A-processen och balans/tvättbuffert, fyllmedel, eluentsammansättning och eluerings-pH-värde. Den gemensamma nämnaren för gruppen med låg LRV är att råvaran är ganska komplex, och det kan vara så att den komplexa interaktionen mellan råvara och fyllmedel negativt påverkar förmågan hos den kromatografiska kolonnen att ta bort virus.

 

3.2.2 AEX (Flow Through Mode)

Strauss et al. visade att pH och konduktivitet hos AEX-prover kan påverka LRV. De statistiska resultaten från Miesegaes et al visade dock att, i likhet med ProteinA, hade LRV för AEX (flödespenetrationsläge) ingen signifikant korrelation med olika buffertar, fyllmedel, pH och konduktivitet, vilket kan bero på optimering av pH och konduktivitet. i de redovisade ärendeprocessförhållandena.

 

3.2.3 CEX(Bindning - Elueringsläge)

Virusborttagning med CEX-processen är inte tillräckligt robust. Det fanns ingen signifikant korrelation mellan LRV i gruppen med hög LRV och bufferten, erfarenhetsnivån eller några kromatografiska kolonnegenskaper, såsom kolonnhöjd och hartstyp. Emellertid var jämvikts-/belastnings- och eluerings-pH-värdena som användes i hög LRV-studien båda lägre, vid 5,3±0.2; I gruppen med låg LRV var pH 6.0±0.2. En annan faktor är att saltkoncentrationen i bufferten också kan orsaka LRV-värdesskillnaden. Bufferten som användes i den låga LRV-studien hade en högre saltkoncentration, med en genomsnittlig koncentration på 290±120 mM i laddnings-/balanseringslösningen och 340±70 mM i eluenten, medan koncentrationerna av NaCl i den höga LRV-studien var 58 ±27 mM respektive 183±31 mM.

 

3.2.4 Inaktivering av lågt pH

I processen med lågt pH är pH en nyckelprocessparameter, och ett pH på 3,8 är tillräckligt för att inaktivera retroviruset i grad. Den låga LRV-gruppen hade ett pH på 3,9, medan den höga LRV-studien hade ett pH på 3,4.

 

3.2.5 Ta bort virusfiltrering

För filter med både små och stora bländare var LRV-värdet för MuLV-borttagning inte mindre än 2log10, och endast 1% av studierna var under 3log10 (visas i kolumnerna h och i i figur 2). Den totala elimineringen av retrovirus med virusfilter med stor öppning var lägre än med virusfilter med liten öppning (som visas i C-stapeldiagrammet i figur 1). Den främsta orsaken som påverkar resultatet av borttagning av parvovirus är de olika filtertyperna. I allmänhet kan antivirusfiltrering på ett tillförlitligt sätt ta bort virus.

Processerna är Protein A(a), AEX-penetrationsläge (b), CEX-bindning - elueringsläge (c), AEX-bindning Ⅰ elueringsläge (d), låg pH-inaktivering ("ofullständig "och" fullständig "clearance)(e ~ g), och stor porstorlek (h) och liten porstorlek (i ~ j) devirusfiltrering (där, a ~ i: Retrovirus; j: Parvovirus).

 

04 Innovationer och utmaningar i virussäkerhetsbedömning

Den kontinuerliga utvecklingen och innovationen inom området för nedströms biofarmaceutiska processer kommer oundvikligen att medföra innovationer inom virusrensningsbedömning. Framsteg i uppströms- och nedströmsprocesser - såsom kontinuerliga bioprocesser - har gjort det nödvändigt att bedöma och etablera effektiva och robusta processer för att avlägsna virus. Under kontinuerligt flöde förväntas steg som virusinaktivering och virusfiltrering fortfarande utföras i batchläge. Även om virusborttagningsförmågan hos kromatografiska processer i kontinuerligt flödesläge inte bör skilja sig väsentligt från den för batchbearbetning, måste den stödjas av data.

 

05 Utsikter

Ur ett virologiskt säkerhetsperspektiv kan den biofarmaceutiska industrins utmärkta säkerhet till stor del tillskrivas industrins strikta efterlevnad av tre nyckelstrategier för virussäkerhet: adekvat anskaffning och testning av material och cellbankskällor, dokumentering av virusclearance-bedömningar (virusvalideringsstudier) och pågående virustestning. Egenskaperna hos biologiska läkemedel som produceras av nya cellsubstrat kan förändras med olika risker, och bra riskhanteringsstrategier krävs för att säkerställa säkerheten hos biologiska läkemedel. Guidling Technology har erfaret professionellt tekniskt team, som täcker filtreringsprocessen från små försök, pilotförsök, till storskalig produktion, våra membran- och membranfilter används ofta i förfiltrering, mikrofiltrering, ultrafiltrering, nanofiltreringskoncentration, extraktion och separation; Våra många produktlinjer, från små laboratoriefiltrering för engångsbruk till produktionsorienterade filtreringssystem, sterilitetstestning, fermentering, cellodling med mera, säkerställer ökad produktivitet.

Jiuling för att säkerställa produktkvalitet som den första indikatorn, i jakten på "minska kostnaderna, öka effektiviteten" på vägen att utforska, ser fram emot att arbeta med dig i framtiden för att möta utmaningarna i branschen och söka bättre utveckling.