Teknik för inaktivering och virusborttagning av blodprodukter

Blodprodukter är "plasmaproteinkomponenter eller blodcellskomponenter, såsom humant blodalbumin, humant immunglobulin, human koagulationsfaktor (naturlig eller rekombinant) röda blodkroppskoncentrat, etc., separerade från frisk human plasma eller specifikt immun human plasma, renad eller tillverkad av rekombinant DNA-teknik, för diagnos, terapi eller passiv immunprofylax". Blodprodukter spelar en viktig roll i medicinsk nödsituation, räddning av krigsskador och förebyggande och behandling av vissa specifika sjukdomar.

 

Regulatorisk bakgrund

Säkerhetsföreskrifter måste säkerställa att det slutliga läkemedlet är säkert för tillsynsmyndigheter och i slutändan för patienter och allmänheten. På 1990-talet utfärdade den internationella samordningskonferensen (ICH 1998) "Q5A: Viral Safety Assessment of Biotechnological products of Human or animal Origin Cellines" (Q5A: Viral Safety Assessment), som etablerar en världsomspännande standard för virussäkerhet.

ICH Q5A beskriver ett flerskiktsschema för testning och clearingvalidering för att uppnå detta mål. Testprogrammet fokuserar på cellbank, råmaterial och bioreaktorskörd, kompletterat med produktriskanalys. Förutom testning kräver ICH Q5A att nedströmsdekontaminering utvärderas som en felsäker åtgärd när inga föroreningar upptäcks uppströms. Clearanceverifiering säkerställer att om något virus undviker testregimen kan det tas bort och/eller inaktiveras innan det hamnar i den slutliga läkemedelsprodukten.

 

Bakgrund till det övergripande virussäkerhetsprogrammet

I modern biotekniktillverkning (eller biobearbetning) finns det vanligtvis tre eller fyra enhetsoperationer i hela den renade sekvensen, som kan ta bort eller inaktivera viruset. Detta inkluderar vissa kromatografiska steg (som protein A eller anjonbyte), odling av lågt pH eller rengöringsmedel och virusretentionsfilter. Alla dessa steg kommer inte att effektivt ta bort eller inaktivera alla virus.

Till exempel är odling med lågt pH vanligtvis ineffektiv för inaktivering av virus utan hölje, men det fungerar bra för inaktivering av hölje av virus. Under vissa driftsförhållanden kanske anjonbytarkolonnen inte kan binda och avlägsna neutrala isoelektriska virus från produktströmmen, men den är effektiv mot sura virus.

Det är en kombination av tre till fyra oberoende och ortogonala enhetsoperationer som tillsammans säkerställer virussäkerheten för bioteknikprodukter.

 

Det antas allmänt att ett robust, effektivt och tillförlitligt bearbetningssteg kommer att kunna ta bort eller inaktivera ett stort antal virus (typiskt definierat som 4 log10 eller högre, där logreduktionsvärdet eller LRV beräknas som log10 av det totala antalet antal virus i inmatningen dividerat med det totala antalet virus i utdata). LRV kan dock inte användas som ett enda absolut mått på ett stegs effektivitet. Uppgifterna kan vara preliminära. Det är lätt att modellera, relativt okänsligt för förändringar i processförhållanden och effektivt mot en rad virus (WHO 2004).

Viral filtrering är allmänt erkänt som ett så kraftfullt och effektivt processsteg och är en nyckelkomponent i den övergripande strategin för att minimera risken för exogena och endogena viruspartiklar under tillverkningen av biotekniska produkter.

Virala filter fungerar ofta genom starka, storleksbaserade retentionsmekanismer. Baserat på denna kraftfulla verkningsmekanism är det mer sannolikt att virala filter än kromatografiska steg ger förutsägbar viral retention för en rad virus. Detta beror på att filtret är mindre sannolikt att påverkas av skillnader i de fysikalisk-kemiska egenskaperna hos olika virus och interaktioner mellan virus och harts som regleras av driftsförhållanden. Därför används det virala filtreringssteget ofta i väldesignade rekombinanta terapeutiska proteinreningsprocesser (EMEA 1996), som också har visat sig ha robusta prestanda inom plasmabearbetningsindustrin.

 

Men blodprodukter är som ett tveeggat svärd, som inte bara räddar tusentals liv, utan också har möjlighet att sprida sjukdomar och utgöra ett hot mot människors hälsa. Enligt statistik från 1977 till 1984 fick minst 30,000 blodmottagare i USA blod infekterat med AIDS-virus. År 1985 infekterades 1 200 av 3 000 blödarsjuka i Frankrike med AIDS genom blodtransfusioner eller blodprodukter.

Enligt Världshälsoorganisationen orsakas 5–10 % av AIDS-infektionerna världen över av transfusioner av AIDS-infekterat blod eller blodprodukter. Det första fallet av AIDS i Kina infekterades genom att använda importerade blodprodukter infekterade med AIDS-virus. Dessutom har överföring av hepatit B- och C-sjukdomar på grund av transfusion av blod och blodprodukter också rapporterats.

 

1. Huvudsakliga virus som överförs av blodprodukter och deras egenskaper

Det finns många typer av virus som överförs genom blod och blodprodukter, som visas i tabell 1. Bland dem har HIV, HBV och HCV varit oroade av inhemska och utländska medicinska kretsar på grund av deras höga infektionsfrekvens och allvarliga skador.

Eftersom blod och blodprodukter har möjlighet att sprida virus, har det allvarligt påverkat dess tillämpning vid förebyggande och behandling av sjukdomar. Vid produktion av blodprodukter måste därför processer för inaktivering och avlägsnande av virus läggas till för att säkerställa säkerheten för blodprodukter.

2. Huvudmetoder för inaktivering och avlägsnande av virus

För att säkerställa säkerheten för blodprodukter, förutom valet av blodgivare, immunisering där så är möjligt, och strikt testning av insamlat blod och andra åtgärder, är inaktivering och avlägsnande av virusbehandling av blodprodukter en viktig länk för att säkerställa säkerhet vid blodtransfusion. Flera vanliga och effektiva metoder för att inaktivera och ta bort virus beskrivs i detalj nedan.

 

I. Virusinaktiveringsmetoder

1. Pasteurmetod

Den teoretiska grunden för denna metod är att destruktionshastigheten för virusstrukturen är mycket högre än proteinstrukturens genom val av temperatur och verkanstid. Nästan 50 års kliniska användningsresultat och nya djurförsök har bekräftat att albumin i lösning efter 60 graders, 10 timmars värmebehandling, det vill säga Pasteur-desinfektion, inte bara kan inaktivera HBV, utan också inaktivera HCV och HIV, vilket gör albumin till det mest pålitliga blodprodukt i virussäkerhet.

Nyligen har Pasteurs process utvidgats till att omfatta produktion av IVIG, FVI, FIX, fibrinogen och andra produkter. Bridonnccu et al. lade denna virusinaktiveringsprocessen till IVIG-processen för lågtemperaturetanolproduktion, det vill säga Pasteurmetoden implementerades under förhållanden utan stabilisator, låg salthalt och surhet, och virustitern minskade med 5 Log. Simmonds et al. testade transfusionsöverfört virus (TTV) av FVⅢ- och FIX-koncentrerade preparat som används kliniskt i Storbritannien och fann att TTV-detekteringsfrekvensen för produkter utan Pasteur-virusinaktivering var 50 % till 75 %, och den positiva detektionsfrekvensen av produkter efter Pasteur-inaktivering var 0.

Den positiva andelen TTV var 27 % hos 84 blödarsjukapatienter i Storbritannien som använde icke-inaktiverade koagulationsfaktorprodukter, medan endast 1 av 19 patienter som använde virusinaktiverade koagulationsfaktorprodukter var positiva, med en positiv upptäcktsfrekvens på 5 %. Därför är virusinaktiveringsprocessen mycket effektiv för att förbättra säkerheten för blodprodukter.

 

2. Organiskt lösningsmedel kombinerat med ytaktivt ämne (S/D-metoden)

This method was first established by Horowitz et al., a blood center in New York, the principle is that organic solvents can make lipids fall off the surface of the virus, so that the structure of the virus is destroyed and the infection activity is lost. The common S/D method uses n-butyl triphosphate (TNBP) in combination with different surfactants such as Tine80, Triton X100, and sodium cholate. The effect of S/D method on the inactivation of lipid-coated viruses in blood products has been confirmed. For example, when FI concentrated preparations were treated with 0.3%TNBP and 0.2% sodium cholate at 24℃ for 6 h, the inactivation of HBV and HCV was >4 Log,HIV >4.5 Log, and the inactivation of VSV and Sindbis viruses was >4.5 Log, and the recovery rate of FVIII was >90 %. Ett stort antal blodprodukter som inaktiverats med S/D-metoden har visat sig vara säkra och tillförlitliga genom långvarig klinisk tillämpning, så de används i stor utsträckning. Denna metod har dock ingen inaktiveringsförmåga mot parvovirus B19, HEV och andra icke-lipo-belagda virus.

 

3. Metod för inaktivering av torr värme

Torr värmeinaktivering innebär att det frystorkade preparatet behandlas genom upphettning och viruset dödas av torr värme. Vanliga torrvärmemetoder är 60 grader ~80 grader, 10~72 timmars uppvärmningsmetod och 80 graders, 72 timmars behandlingsmetod. Så tidigt som i början av 1980-talet var det användbart att värma FVIII lyofiliserat koncentrerat preparat och protrombinkomplex vid 60 grader ~ 80 grader i 10 ~ 72 timmar. Det har dock bevisats att denna metod inte helt kan inaktivera HBV, HCV, HIV. Torr värmebehandling vid 80 grader och 72 timmar har visat sig vara effektiv för att inaktivera HBV, HCV och HIV. Det har också nyligen förekommit rapporter om lyofiliserade preparat av koagulationsfaktorer som behandlats vid 100 grader. Xu Jinbo et al behandlade IgG vid 100 grader i 30 minuter och inaktiverade vesikulärt stomatitvirus 8,2 Log. Vissa människor kommer att frysa torkad FVIII vid 68 grader i 72 timmar, i torrt tillstånd och sedan värmas upp vid 100 grader i 0,5 ~ 1 timme. Denna metod är relativt ekonomisk.

 

4. Fotokemisk metod

This method was first proposed by Matthews et al. The principle is that some photosensitizers have a strong affinity for the surface of the virus and the structure of the viral nucleic acid, and are easily activated under appropriate wavelength of light, thus destroying the structure of the virus in contact with them through photochemical action. The photosensitizers that have been used include: hemacoline derivatives, psoralide derivatives, phenothiazines, phthalocyanines, and cyanine 540, etc. The main feature of this method is that it can be used to inactivate the virus of whole plasma, and the inactivation of the virus of platelet products is the current research focus. Scientists from the Department of Experimental Medicine at the University of California in the United States have screened out a new psoralen derivative S-59 among more than 100 chemical modifications of psoralen. The platelets were irradiated with 150 um S-59 combined with 3 J/cm2 UVA, which could inactivate >6.7 Log of free HIV and >6,6 Log av celler bundna till HIV, och trombocyterna förblev bra efter 7 dagars funktionell bevarande in vitro, vilket har godkänts av FDA för kliniska prövningar.

Bland dessa metoder är Pasteur-desinfektionsmetoden och S/D-metoden godkända av USA:s FDA och används ofta i världen. Torr värmeinaktiveringsmetoden är främst lämplig för virusinaktivering av lyofiliserade preparat. Fotokemisk metod har en stark inaktiveringseffekt på lipidbelagda virus och har använts vid helplasmavirusinaktivering i Europa, och har breda utsikter för virusinaktivering i blodcellskomponenter. Alla dessa metoder har dock sina egna brister, såsom Pasteur-sterilisering är inte idealisk för inaktivering av vissa värmeresistenta virus; S/D-metoden kunde inte effektivt inaktivera det icke-lipo-belagda viruset. Den fotokemiska metoden skadade avsevärt aktiviteten hos vissa plasmaproteiner. Den nuvarande kliniska användningen av uppföljningsundersökningar visar att ingen virusinaktiveringsmetod kan garantera att blodprodukter är absolut fria från risken för överföring av virus.

 

I. Process för borttagning av virus

Vid produktion av blodprodukter kan en inaktiveringsprocess inte inaktivera alla virus; Dessutom är viruset i sig ett heterologt protein, såsom inmatning med produkten kommer att ge biverkningar; Samtidigt, på grund av begränsningen av teknisk nivå, finns det fortfarande virus vars egenskaper inte hittas eller förstås, så de befintliga virusinaktiveringsmetoderna kan inte garantera inaktiveringseffekten av dessa virus. Därför kan enbart inaktivering inte garantera produktens säkerhet och måste tas bort från produkten. Så virusborttagningsteknik får mer och mer uppmärksamhet. Två vanligt använda och effektiva virusborttagningsprocesser beskrivs kortfattat nedan.

1. Kromatografisk teknik

Kromatografisk teknologi avser användningen av olika komponenter och stationära fasaffinitets- eller interaktionsskillnader för att uppnå separation av olika komponenter. Som en avancerad teknologi för produktion av blodprodukter har kromatografi i sig effekten att ta bort virus, särskilt affinitetskromatografi och jonbyteskromatografi. För jonbyteskromatografi har eluering fördelar jämfört med penetration vid virusavlägsnande. Tabell 2 visar datastatistiken för HAV-avlägsnandehastighet genom kromatografisk teknologi i processen för albuminproduktion av CSL Company i Australien. Som framgår av tabell 2 är jonbyteskromatografi och gelfiltrering mer effektiva för att avlägsna HAV, med en total avlägsningshastighet på 10,9 log.

I produktionen av FVIII utför Baxter Healtheare immunaffinitetskromatografi med anti-FVIII-antikroppsbehandlade geler, som kan ta bort (4,2±0.1)Log och (5.3±0.9)Log från icke -lipidbelagda virus såsom PPV respektive HAV.

 

2. Nanofilmfiltrering

För vissa virus med liten ytdiameter, såsom HAV och parvovirus B19, är nanomembranfiltrering den mest effektiva borttagningsmetoden. Det drar fördel av storleksskillnaden mellan proteiner och virus och adsorptionen av virus av filtermembranet för att isolera virus. En laboratoriestudie genomfördes på Sanquin Blood Supply Site i Nederländerna om avlägsnande av virus genom att lägga till en ettstegs, tvåstegs Planova 15N nanomembranfiltrering till protrombinkomplexproduktionsprocessen. Det visade sig att avlägsnandet av HIV, HAV och andra virus ökade i varierande grad efter nanomembranfiltrering (se tabell 3).

Emellertid kan följande problem uppstå när denna metod tillämpas på industriell produktion: För det första, på grund av produktens höga viskositet och närvaron av proteiner med stor diameter, bör porstorleken på membranet som väljs av filtret inte vara för liten, sålunda begränsar avlägsnandet av virus med liten diameter såsom HCV; För det andra kommer stabiliteten av membranporstorlekskontroll i processen för filterproduktion att påverka avlägsnandet av virus. För det tredje, när membranöppningen som är mindre än viruspartikelns diameter blockeras, kommer produktflödet att minska, vilket påverkar utbytet. Därför är valet av membran vars egenskaper och porstorlek är lämpliga för de bearbetade produkternas behov en viktig faktor för om nanomembranfiltreringen kan ta bort virus.

 

3. Diskussion

Under förutsättningen att säkerställa kvaliteten på blodkällan är processen för inaktivering och avlägsnande av virus ett viktigt och nödvändigt medel för att säkerställa säkerheten för blodprodukter. Användningen av endast en inaktiverad virusprocess kan inte absolut garantera säkerheten för blodprodukter. På basis av virusinaktiveringstekniken tillsattes virusborttagningstekniken såsom kromatografi och nanofilmfiltrering, virusavlägsningshastigheten ökades kraftigt och virusinaktiverings- och avlägsnandeeffekten förbättrades avsevärt. För närvarande har Europa tydligt föreslagit att i produktionsprocessen av blodprodukter måste minst en inaktivering och avlägsnande av virus användas för att garantera säkerheten för blodprodukter.

I Kina använder de flesta tillverkare av blodprodukter endast en inaktiverad virusprocess i produktionsprocessen, såsom Pasteur-desinfektionsmetoden, S/D-metoden, etc., men använder inte virusborttagningsprocessen, vilket allvarligt påverkar kvaliteten på blodprodukter. Med Kinas anslutning till WTO kommer produktionsprocessen och kvalitetsstandarderna för inhemska blodprodukter att vara i linje med världen, annars kan det inte garantera den befintliga inhemska marknadsandelen, men kan inte heller konkurrera med liknande produkter i andra länder i internationella marknaden.

Därför måste Kinas tillverkare av blodprodukter förbättra produktionsprocessen, stärka inaktiveringen och avlägsnandet av viruset för att till fullo säkerställa produktens kvalitet och säkerhet. Därför kommer det att vara trenden för kinesiska tillverkare av blodprodukter att använda kromatografi för att rena blodprodukter och ta bort virus för att säkerställa säkerheten för blodprodukter.

 

Om Guidling

 

Guidling Technology är ett nationellt högteknologiskt företag med fokus på bioläkemedel, cellodling, rening och koncentration av biomedicin, diagnos och industriella vätskor. Vi har framgångsrikt utvecklat centrifugalfilteranordningar, ultrafiltrerings- och mikrofiltreringskassetter, virusfilter, TFF-system, djupfilter, ihåliga fibrer, etc. Som fullt ut uppfyller tillämpningsscenarierna för bioläkemedel, cellodling och så vidare. Våra membran och membranfilter används i stor utsträckning vid koncentrering, extraktion och separation av förfiltrering, mikrofiltrering, ultrafiltrering och nanofiltrering. Våra många produktlinjer, från små laboratoriefiltrering för engångsbruk till produktionsfiltreringssystem, sterilitetstestning, fermentering, cellodling och mer, möter behoven för testning och produktion. Guidling Technology ser fram emot att samarbeta med dig!