Försiktighetsåtgärder för användning av ultrafiltreringsrör
(1) Välj lämpligt ultrafiltreringsrör. I allmänhet bör den molekylvikt som ska behållas inte vara större än 1 / 3 av målproteinets molekylvikt. Till exempel, om målproteinets molekylvikt är 35kDa, kan ultrafiltreringsröret med 10kDa molekylvikt väljas. Om målproteinets molekylvikt är ca 10kd kan ett ultrafiltreringsrör med en molekylvikt på 3KD användas. Läs noggrant bruksanvisningen och var uppmärksam på den olika toleransen för ultrafiltreringsmembran till olika kemikalier.
(2) Den nyinköpta ultrafiltrationen är torr. Tillsätt ultrapure vatten före användning, och vattnet kommer helt att passera genom membranet. Kyl den i ett isbad eller kylskåp i några minuter. Häll sedan ut vattnet och tillsätt proteinlösningen. Det tillsatta beloppet får inte överstiga den vita linjen på toppen av röret. Operationen ska vara lätt. Innan du lägger till proteinlösning måste ultrafiltreringsröret sättas in på is för förkylning.
(3) Saldo. Både massa och tyngdpunkt bör balanseras. Observera att hastigheten och accelerationen inte bör vara för snabb, annars kommer ultrafiltreringsmembranet att skadas direkt. Starta centrifugal ultrafiltrering (centrifugförkylning till 4 grader). När varvtalet för olika centrifuger omvandlats till G är det annorlunda. Justera centrifugens acceleration till den lägsta växeln för att minska trycket på membranet. Observera att du måste vänta tills centrifugen når målhastigheten innan du lämnar centrifugen, annars när det är problem med centrifugen kan du inte hantera den första gången. Membranets och den roterande axelns riktning ska justeras enligt anvisningarna (när det gäller vinkelroterande centrifug är membranet vinkelrätt mot axeln). I praktisk användning är hastigheten i allmänhet lägre än i handboken, vilket kan förlänga centrifugalrörets livslängd.
(4) När den är koncentrerad till de återstående 1ml, ta 50ul buffertlösning och tillsätt 10ul för att flöda igenom för att se om den blir blå, för att bedöma om ultrafiltreringsröret läcker protein. Om röret läcker, häll det övre lagret och flöda genom det nya röret och starta ultrafiltrering. För att noggrant bedöma om röret läcker, centrifugera med 5mgml BSA i 10min, ta sedan flödet igenom, kör proteinlim eller Bradford för grov mätning och fortsätt att tillsätta den återstående proteinlösningen för koncentration (arbeta på is för att förhindra att proteinet värms upp) tills alla koncentrerade lösningar tillsätts. Var uppmärksam på om proteinutfällning uppstår under centrifugering, vilket resulterar i rörblockering. Om nederbörd uppstår, bestäm den specifika orsaken till nederbörd, om proteinkoncentrationen är för hög eller om bufferten är olämplig; Den förstnämnda kan lösas genom samtidig ultrafiltrering med flera ultrafiltreringsrör för att minska koncentrationen. Det senare är att ändra olika buffertlösningar tills proteinet inte fälls ut.
(5) De föregående stegen används för att koncentrera protein. Om du vill ändra bufferten, när den totala proteinlösningen är koncentrerad till ca 1 ml, tillsätt försiktigt en ny buffert (ultrafiltrering genom 0,22um ultrafiltreringsmembran) och koncentrera dig sedan till ca 1 ml tre gånger i följd. Den slutliga volymen av den sista koncentrationen beror på den erforderliga proteinkoncentrationen, som i allmänhet inte är mer än 500ul, eller den kan koncentreras till mindre än 200ul. Enligt volymkoncentrationen på minst 10 gånger varje gång kan den nå mer än 1000 gånger tre gånger, vilket i princip kan uppnå syftet att ändra bufferten.
